| 剖検諸臓器組織内の含鉄小体検出のための試料溶解法 斎藤勝美＊１ 武藤一＊２ 蜂谷紀之＊１ 滝澤行雄＊１ ＊１秋田大学医学部公衆衛生学講座，＊２秋田大学有害廃液処理施設 |
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Digestion Method for Detection of Feffuginous Bodies in Human Tissues from Autopsy Cases Katsumi SAITOH ＊１， Hajime MUTO＊2， Noriyuki HACHlYA＊1 and Yukio TAKlZAWA＊1 |
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緒言 剖検諸臓器組織内からの含鉄小体（石綿小体）の検出は，石綿暴露と職業的背景との因果関係を検討するうえで必要である。また，一般剖検例からのこれらの検出は，一 般住民に対する石綿暴露実態を知るうえでも重要である。含鉄小体の測定には，位相差顕微鏡法と電子顕微鏡法が用いられているが，標本作製のためには試料を溶解するか灰化する操作が不可欠である。生体試料の標本作製方法としては，いろいろな方法が提案されており，肺組織に関しては次亜塩素酸ナトリウム法 1〜4）およぴ水酸化カリウム法 5.6)の湿式溶解法と低温灰化処理法 7），肺組織を含めた諸臓器組織に関しては水酸化カリウム法 6)と低温灰化処理法 8)が用いられている。湿式溶解法には，溶解条件や溶解後の処理条件を変えた幾個かの方法が提案されている 1)-6)が，これらの方法についての比較検討はなされておらず，Gylsethら 7)が国際対癌連合(U．l．C．C．)の標準生体試料と肺組織を用いて，次亜塩素酸ナトリウム法，高温灰化処理法およぴ低温灰化処理法を比較検討しているにすぎない。湿式溶解法について は，組織の溶解過程で使用ガラス器具表面への繊維の付着 7)やクロロホルム，エタノールによる夾雑物の除去過程での繊維損失 9)が指摘されており，同じ溶解試薬による方法でも，溶解条件や溶解後の処理条件によっては含鉄小体およぴ無機繊維の計測値に違いが生ずることが考えられる。 そこで，著者らは石綿暴露による疾患と関連性の深い肺組織と大網組織を対象に，これまで行われている湿式溶解法について比較検討した。また，簡便で短時問に多くの試料を処理することができ，従来の湿式溶解法と同様に含鉄小体およぴ無機繊維を生体組織中から検出できる位相差顕微鏡法での湿式溶解法を提案した。 実験方法 １．試料 秋田市内のＫ病院で，1987年に悪性腹膜中皮腫により死亡した男性62才の剖検例と1988年に心疾患で死亡した男性63才の剖検例の左右肺下葉組織およぴ大綱組織を試料とした。左右肺下葉組織および大網組織は10％のホルマリソで固定されたものを用い，試料はPolytroneホモジナイザーで純水を用いてホモジナイズし，フィルター（東洋口紙5A）でろ過した後に風乾した。なお，風乾した試料0.5gは湿重量1.0gに相当した。 ２．比較検討した溶解法 比較検討した溶解法は，次亜塩素酸ナトリウムによる溶解法としてはSmith＆Naylof法D，Chuｒgら 2)の方法およぴChufg＆Wafnockの変法 4)とし，水酸化カリウムによる溶解法としてはAshcfoft＆Heppleston 5)の方法とKobayashiら 6)の方法を実施した。なお，吸引ろ過の際に用いたメンプランフィルターは，いずれの方法ともMilliporeフィルターTypeAA（0.8μm，47mm¢）を用いた。 ３．簡便溶解法 溶解法の手順をFig‐1に示した。この方法は，Ashcfoft＆Heppleston 5)による方法を基本に，使用ガラス器具表面への繊維の付着や夾雑物の除去過程での繊維損失の影響を少なくするため，遠沈後の上清を除去する操作を省き，吸引ろ過の際に壁面に付着している石綿小体および石綿繊維を50mlの純水で洗浄する操作を付け加えた。 |
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| ４．標本の作製と計測方法 試料を採取したメンブランフィルターを２等分し，その一つをスライドガラスの上に乗せ，日本石綿協会のアセトン−トリアセチン法 10)によりフィルターを透明化してカバーガラスで封入した。なお，１試料，１溶解法に対して，含鉄小体の計測を３回実施するため，標本は３個作製した。 計測には，接眼鏡の中にアイピースグレイテイクル（倍率400倍で0.25mm x0.25mm）を入れた倍率400倍の位相差顕微鏡（オリンパス，BH1）を用いた。検眼は標本全体にわたって行った。 ５．各溶解法の比較の検定法 各溶解法による含鉄小体およぴ無機織維の計測値の違いの検討は，独立多試料の順位変数検定法であるKruskal‐Wallisの検定法と２試料の順位変数検定法であるMann‐WhitneyのU−検定法を用いた。 結果および考察 １．比較検討した溶解法 左右肺下葉組織および大網組織を試料とし，これを各種溶解法により処理して標本を作製し，その結果を比較検討した。次亜塩素酸ナトリウム溶解法については，これまで肺組織についての報告がなされている。この方法で大網組織についても溶解を試みたが，肺組織のように溶解せず，溶解開始から一遇問後でも大網組織にはほとんど変化はなかった。これに対して，水酸化カリウム溶解法では，肺組織およぴ大網組織とも溶解された。また，水酸化カリウム溶解法では，短時間に試料を処理することができた。したがって，次亜塩素酸ナトリウム溶解法は，肺組織のように脂質分が少ない組織に限って適用可能な方法と言えるが，水酸化カリウム溶解法は，Kobayashiら 6)が諸臓器組織の溶解に対して用いているように，各組織の溶解に適用てきる方法と考えられる。 このようにして得られた標本について，位相差顕微鏡を用いて含鉄小体およぴ無機繊維を計測し，乾重量1.0g当りの値をTable１に示した。この計測結果について，各溶解法による含鉄小体およぴ無機繊維の計測値の違いを検討した。肺組織に関しては，次亜塩素酸ナトリウム溶解法が３種類，水酸化カリウム溶解法が２種類の方法で行ったので，独立多試料の順位変数検定法であるKruska1‐Wallisの検定法，大網組織に関しては，２種類の水酸化カリウム溶解法のみであるので，２試料の順位変数検定法である Mann‐WhitneyのＵ-検定法を用いた。Case１、Case2別に含鉄小体と無機繊維の計測値について溶解法問で比較した結果，肺組織，大網踵瘍組織および大網非踵瘍組織とも有意な差は認められなかった。したがって，今回比較検討した各溶解法については，含鉄小体およぴ無機繊維の計測結果には違いが生しないと考えられる。 湿式溶解法については，組織の溶解過程で便用ガラス器具表面への繊維の付着やクロロホルム・エタノールによる夾雑物の除去過程での繊維損失がGylsethら 7)および川見ら 9)により示唆されている。これらによる影響の程度を検討するため，使用後のガラス器具を純水で十分に洗浄し，この洗浄液ならびに夾雑物の除去週程て用いたクロロホルム・エタノールを，それぞれMilliporeメンプランフィルター時TypeAAにより吸引ろ過して，フィルター上の含鉄小体およぴ無機繊維の計測をした。その結果，メンブランフィルター上からは含鉄小体およぴ無機繊維は検出されず，Gylsethら 7)およぴ川見ら 9)が指摘しているような影響はみられなかった。メンブランフィルター上から含鉄小体および無機繊維が検出されなかった理由としては，1)ガラス器具の壁に付着していた含鉄小体および無機繊維を十分に純水で洗浄したこと，2)夾雑物を合むクロロホルム・エタノール層のみを，注意深く駒込ピペットで除去したことによると考えられる。 ２．簡便溶解法 提案した簡便法により行った含鉄小体およぴ無機繊維の計測した結果を，乾重量1.0g当りの値としてTable2に示した。この簡使法による含鉄小体およぴ無機繊維の計測結果が，他の溶解法のそれと違いがあるかを検討するため，Talble2に示した結果とTable1の結果との間で，Case1，Case2それぞれについて含鉄小体と無機繊維の計測値（Table1については各方法の値の総計）ごとにMann‐WhitneyのＵ-検定を行った。その結果，肺組織．大綱腫瘍組織および大網非腫瘍組織とも計測値に有意な差は認められず，簡便法を用いて行っても，Table1の方法による結果と同様のものが得られた。また，本法によって観測された肺組織内の含鉄小体の形態像をFlg‐2に，大網組織内のそれをFig‐3に示した。 今回提案した方法は，Ｄピーカーから遠沈管に移す操作，２）炭粉除去の操作，３）クロロホルム・エタノールによる夾雑物除去の操作など含鉄小体およぴ無機繊維の損失する可能性が考えられる操作を省き，溶解を１本の遠沈管内で行うものである。これは，特別な機器が不要で操作も簡単であり，吸引ろ週の際に十分に洗浄すれば，従来の溶解法による測定結果と同様の結果が得られる。本法は，短時間に多くの試料を処理することがてきる有用な溶解法と言える。また，この溶解法は，Kobayashiら 6)が諸臓器組織の溶解に使用したのと同し水酸化カリウムを用いた方法であることから，各組織の溶解に適用できる方法と考えられる。 |
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| 結語 剖検諸臓器組織内からの含鉄小体（石綿小体）の検出の際に行われる湿式溶解法について，これまで行われている方法を検討し，また諸臓器組織に対して簡便で有用な湿式溶解法を提案した。その結果は以下のとおりであった。 １．次亜塩素酸ナトリウム溶解法では，肺組織は溶解されたが，大網組織は溶解されなかった。これに対して，水酸化カリウム溶解法では，肺組織およぴ大網組織とも溶解された。 ２．これまで行われている溶解法による含鉄小体およぴ無機繊維の計測結果を，Kruskal･Wallisの検定法およぴMann‐WhitneyのＵ検定法で比較検討した結果，肺組織，大網腫蕩組織および大綱非腫瘍組織とも有意な差は認められなかった。 ３．湿式溶解法については，使用ガラス器具表面への繊維の付着や夾雑物の除去過程での繊維損失が示唆されているが，これらについては，使用ガラス器具を十分に洗浄すること，注意深く夾雑物を含んだクロロホルム・工タノール層を除去することで，繊維の損失を防止することができると考えられた。 ４．提案した簡便方法とこれまで行われている溶解法による含鉄小体および無機繊維について，Mann‐WhitneyのＵ検定法で比較検討した結果，肺組織，大綱腫瘍腫組織および大網非腫瘍組織とも有意な差は認められなかった。 ５．提案した方法は，合鉄小体およぴ無機繊維が損失すると考えられる操作を省き，溶解を１本の遠沈管内で行い，特別な機器は不要でしかも簡単で，有用な溶解法である。 |
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謝辞 剖検諸臓器組織の提供をいただいた秋田組合総合病院の佐藤錬一郎副院長に深謝します。 文献 1)Smith，M．J．and Naylor，B．A method of extracting ferruginous bodies from sputum and pulmonary tissue ，Am‐J．Clin‐Pathol.58,250-254(1972) 2)Chufg，A．，Sakoda，N．and Warnock，M．：A simple method for preparing ferruginous bodies for electron microscopic examination，Am．J．Clin. Pathol.,68,513-517(1977) 3)Chufg，A．and Warnock，M．L．:Asbestos fiber in the general population，Am.Rev.Respir.Dis.,122,669-678(1980) 4)宍戸真司：一般住民肺の石綿汚染に関する研究，第２報含鉄小体の中心線維およぴ微小線維の鉱物学的検討，奈医誌，37,224−237（1986） 5)Ashcroft，T．and Heppleston，A．G．:The optical and electron microscopic determination of pulmonary asbestos fibre concentration and its relation to the human pathologlcal reaction，J．Clm.‐Pathol.,26,224-234(1973) 6)Kobayashi，H．，Watanabe，H．and Zhang，W．M．：Aquantltahve and histological study on pulmonary effects of asbestos exposure in general autopsied lungs， Acta Pathol．Jpn,、36,1781−1791(1986) 7)Gylseth，B．，Baunan，R．H,and Bruun，R∴ Analysis of ironorganic fiber concentrations in bilogical samples by scanning electron， Scand．J．Work Environ‐Health，7,101-108(1981) 8)Auerbach，O.,Conston，A．S．，Garfinkel，L．，Parks．V．R．，Kaslow，H．D．and Hammond，E．C ∴Presence of asbestos bodies in organs other than the lung，Chest，77，133-137(1980) 9)川見正機，川見昌子，海老原勇：石綿暴露指標としての肺組織内石綿織維及び含鉄小体濃度の測定法の確立とその検討，労働科学，66，1−23(1990) 10)（社）日本石綿協会編：室内環境等におげる石綿粉じん濃度測定法，p.6‐12，（社）日本作業環境測定協会，東京（1988） （受付1992年6月18日受理1992年11月26日） 日衛誌(Jpn.J.Hyg.),48,596-600(1993)より転載 |