 ESI-NEWS Vol.25 No.5 2007 より転載 |
| １．はじめに 発がんは、がん形質変化が多段階に積み重なって起きることが臨床的な観察をもとに古くから知られている。そして、段階的に進む形質変化のそれぞれに密接に関係する遺伝子が存在し、その遺伝子に突然変異が起きることが発がんの第一歩でありアクセルであると考えられてきた。この考え方は､“発がんの多段階突然変異説"として､現在、最も有力な発がん機構に関する仮説である。突然変異の原因はDNA損傷であり、初期DNA損傷量は被ばく線量に比例するので、放射線量が如何に小さくても発がんのリスクが存在するというLNT(Linear Non-Therethold)仮説が放射線防護の基盤となる考えとして受け入れられてきた。 しかし、依然としてこの仮説は実証されておらず発がんの全容を見渡すという視点でみると何らかの矛盾を伴っていることが多い。最も基本的な矛盾は、細胞がん化頻度が突然変異頻度に比べて桁違いに大きいという事実にある。もし、“発がんの多段階突然変異説"が正しいとすれば、細胞がん化頻度は、一段階ごとの突然変異率を掛け合わせた値になり、単独の突然変異頻度より大きくなることはあり得ないはずである。この矛盾は、多くの研究者によって繰り返し報告されてきたが、現在まで満足いく説明はなされていない。このことは、放射線防護上、最も重要な低線量放射線被ばく時の確率的影響を推測するために明らかにされねばならない問題である。この点について、国際放射線防護委員会は、その勧告に、現状では、低線量域の発がんについて閥値があるかどうかを明確に示す根拠に乏しいので放射線防護上から閥値なしの立場をとると記載している。一方、BEIR-VII報告書は、放射線発がんの機序としてDNA損傷起源の突然変異説をとりいれLNT仮説を支持し、フランス科学アカデミー報告は、低線量被ばくに対する生体の防護応答機構の存在によって100mSV以下に閥値があるとの立場を表明している。 こうした背景にあって、私は、過去30年余の研究成果を総合的に解析し、放射線による細胞がん化の主経路は、“DNA損傷→突然変異”を辿る経路ではなく、“タンパク損傷→染色体異数化”を辿る経路であるとする方が多くの矛盾を説明できると結論した。ここでは、私が提案する“発がんのタンパク損傷起源説”を紹介しその是非について批判を受けたい｡私の考えが受け入れられると、LNT仮説の見直が必要になることは必至である。 ２．放射線細胞がん化は単純な突然変異の積み重ねでは起こらない “発がんの突然変異説”は、発がんはがん化に結びつくDNA損傷が生ずる過程（イニシエーション）を終えたのち、自分を取り巻く様々な要因の影響を受けてがん化する過程（プロモーション）を経て起きるという多段階説が基礎となっている。しかし、依然として、この仮説は実証されておらず発がんの全容を見渡すという視点でみると何らかの矛盾を伴っていることが多い。多くの矛盾を指摘することができるが、三十年前に指摘しながら依然として解決されていない疑問は、(１)発がん頻度が個々の体細胞突然変異頻度より遥かに大きいのはなぜか？(２)ヒト細胞とマウス細胞の突然変異感受性は違わないにもかかわらず、ヒト細胞だけが試験管内で発がんさせることが極めて難しいのはなぜか？ということに尽きると思う。 放射線による突然変異の誘導頻度は、ラッセルらの膨大な数のマウスを使った実験の結果から10-5/Gy近辺の値を取ることは良く知られており、がん関連遺伝子における突然変異においても大差はないだろう。しかし、放射線による細胞がん化頻度は、一般的な体細胞遺伝子で観察される変異頻度に比べ極めて高い。私は、Ｘ線を照射したゴールデン・シリアン･ハムスクー(SHE)細胞を二群に分け、一方で細胞悪性形態変化(malignant morphological change)を指標にして細胞がん化頻度を求め、他方で６チオグアニン抵抗性の獲得を指標にHGPRT遺伝子座における体細胞突然変異頻度を調べた2,3)。その結果から、細胞がん化過程のいくつかの特徴を指摘した。第一に、細胞がん化と突然変異誘導パターンが大きく異なることである。突然変異の誘導は、生存率曲線の肩の領域に相当する比較的低線量域(1.5Gy以下)でほとんど増加がみられないが、2Gy以上の線量域になると線量に比例して指数関数的に増加する。 しかし、細胞がん化は、これとは全く異なるパターンで、突然変異が殆ど誘導されない1.5Gy以下の線量域で効率的に誘導された｡1.5Gy以下の線量域における細胞がん化の誘導頻度は平均2 ×10-3Gyで､変異の誘導頻度の10-5/Gyに比べて同じ線量域の突然変異率に比べて極めて高いことがわかる。この事実は、多くの研究者によって繰り返し報告されてきたが、現在まで満足いく説明はなされていない。このようにこ発がん機構の基盤を揺るがすような矛盾であっても、そのまま四半世紀に渡って解決されないままに残されてきた。私は、こうしたことが生ずる原因として、(１)細胞がん化に関係する遺伝子のサイズが極端に大きいのではないか、(2)DNA損傷修復機構に突然変異を起こしやすいものが存在するのではないか、(３)非遺伝的変化が細胞がん化の原因ではないかと考察してきた2）-4)。しかし、がん化に関係する遺伝子として極端にサイズの大きい遺伝子は、未だ知られていない。また、確かに、突然変異を起こしやすいDNA損傷修復機構の存在やDNA損傷修復時の細胞周期チェツクポイントの不備が複製異常を起こし細胞をがん化させる可能性が指摘されているが、これらの現象が生じなくても細胞がん化は、容易に生ずる現象である。最後に残る発がんの原因となる非遺伝的変化が存在するかどうかいまのところ明確ではない。 ３．ヒト細胞は試験管内で簡単にがん化しない その後、一連の細胞がん化研究の結果から、私は、“細胞はがん化しないのが通常の姿ではなく、がん化するのが通常の姿ではないがと考えるようになった。通常、細胞がん化実験では、無限増殖能を獲得し造腫瘍性を持たない細胞が使われる。これらの細胞は、通常の培養状態下では一層にしか増殖しないが、発がん剤処理されると細胞が細胞の上に重なり合って増殖して数層に盛り上がった塊（フォーカス）を形成する。このフォーカス由来の細胞は、その後、造腫瘍性を発現するのでフォーカスの形成頻度を細胞がん化頻度とする。この方法は単純でありながら極めて感度の良い手法として利用されてきた。 しかし、これらの細胞がん化定量系の最大の欠点は、この細胞がすでにがん細胞の最大の特徴である無限増殖能を持ち、染色体の不安定性を示し、細胞密度や血清濃度を低く抑え注意深く培養しないと容易に自然がん化することである。この欠陥を克服する為に､私達は、発生時期を同じ段階に揃えたマウス（12-13日齢）、シリアンハムスター（12-13日齢）、ラット（12-13日齢）およびヒトの胎児（８−９週齢）のカーカスから調整した初代培養細胞を使った実験系を開発して放射線や化学発がん剤による細胞がん化メカニズムの解明を試みてきた。 この実験系を使って細胞がん化のメカニズムに関する研究結果を積み重ねてきたが、新たな多くの疑問が生じてきた。最も重要な疑問は、これらの実験系ではなぜパーセント以上の極めて高い頻度で細胞が無限増殖能を獲得し腫瘍性を獲得するかということである。加えて、私は、シリアンハムスター胎児細胞を始めとするげっ歯類細胞を培養する際、コンフルエント状態を頻繁に経験させると、ほぼ100％の確率で自然にがん化させることが出来るようになった5)。その細胞がん化頻度は、平均的な体細胞突然変異頻度に比べて103から104という桁違いに大きい。しかし、ヒト胎児細胞ではそうした現象は見つからない。こうした細胞レベルにおけるがん化感受性が個体の発がん感受性にどのように反映するか簡単に言及できないが、ヒト個体がマウス個体に比べて細胞レベルのように発がんしにくいという事実はない。それどころかヒトの死因の半数はがんであるといわれる。これらの状況から、私は、細胞のがん化の初期過程には、きわめて高い頻度で生ずる非遺伝的変化が重要な役割を果たしており、ヒト細胞では、個体レベルばかりでなく細胞レベルでその経路が厳密に制御されているため発がんの時期が大きく遅れ長寿ではないか？と考えている。 細胞がん化の過程に、放射線彼ばくに応答する非遺伝的現象が重要な働きを果たしていることは、これまでにも多くの研究結果から指摘されている。Kennedyら(1984)は､放射線照射されたC3H10T1/2細胞における細胞がん化フォーカスの出現頻度は、放射線を照射後、フォーカスアッセイのために植え込む細胞数を希釈してコンフルエントに達するまでの細胞分裂回数を増やすほど増加することを報告した。この現象の解釈は難しいが､彼女らは、放射線による細胞がん化には、二つの事象が必要であり、第一の事象は、放射線照射されたほとんどの細胞で高い頻度で誘導されるものであるが、第二の事象は細胞分裂に絡んで誘導されるもので低い頻度でしか起こらないものであると推測した。 そのため、後者の過程の頻度を上げる可能性が高い放射線照射後の細胞分裂回数が多い細胞集団ほど細胞がん化頻度は高くなる。第一の事象は、通常の体細胞突然変異頻度より極端に高く、集団のすべての細胞に生ずるもので遺伝的変化ではなく非遺伝的変化であると予想している。このことは、細胞がん化につながる非遺伝的変化が細胞分裂を介して子孫に伝えられる性質のものであることも意味している。同様な現象は、ラットにおける放射線誘導乳がんの場合にも見られ、非遺伝性事象ががんを誘導するために組織の微細環境における乳腺幹細胞の細胞分裂が必須であると報告されている（Kamiya et al.,1995）。 4.放射線によるバイアスタンダー効果と遺伝的不安定性 最近、放射線の発がん機構を理解する上で極めて重要な非遺伝的現象が注目されるようになった。それは､”バイスタンダー効果”と”遅延型影響”である。バイスタンダー効果は、被ばくした細胞から周辺の被ばくしなかった細胞へ遠隔的に被ばくの情報が伝えられる現象で、ギヤップジヤンクションを介した細胞間情報伝達機構の関与や放射線被ばくした細胞から培養液に放出（分泌）される物質の関与が考えられている6）。遅延型影響は、放射線被ばくによって生じた初期の損傷を乗り越え生き残った細胞集団に“遺伝的不安定性”が誘導され、長期間に渡って様々な遺伝的変化が非照射時の数〜数10倍の高い頻度で生じ続ける状態が続く現象である。これらの結果は、低線量放射線の発がん影響を考える上で、非標的影響を考慮することが極めて重要であることを示唆している。すなわち、いずれの現象でも、放射線で直接ヒットされなかった細胞であっても発がんする可能性が高いことを意味している。 これまで低線量被ばく時の放射線発がん危険度算定の根拠は、放射線の一次効果は放射線によってエネルギーが付与されるかどうかという物理的確率論にあったので、どんなに少ない線量でも放射線量と生体影響は比例関係にあるとする閥値なし直線（LNT）仮説が用いられていた。 しかし、低線量放射線被ばく時にバイスタンダー効果のために被ばくしていない細胞で発がんが起きるならば、低線量域における発がん頻度を過小評価している可能性がある。こうした効果は、素線量が大きい高LET放射線や低LET放射線であっても5mGy程度以下の低線量で顕著になる。この線量では、個々の細胞の核を一つか二つの電子飛跡が横切ることになるが、被ばくしない細胞が全体の37％、1飛跡の被ばくを受けるのが37％、2飛跡の被ばくが18％となり、被ばくしない細胞の割合が大きくなるので無視できない。もしこういった現象が起きているとすれば、従来、信じられてきた発がんはDNA損傷が原因となって生ずる突然変異によって生ずる”とする“発がんの突然変異説”に重大な疑問が生ずる。 しかし、依然として、遺伝的不安定性の起源となる初期損傷と不安定性を長期間維持する仕祖みは不明なところが多い。遺伝的不安定性は、Ｘ線などDNA切断を起こす要因では誘導されるが、紫外線など切断を生じない要因では誘導されないことから、遺伝的不安定性の原因となる初期損傷は、DNA二重鎖切断である可能性が高いと推測されている。また、遺伝的不安定性の誘導量は、小線量放射線の事前照射で低減化できるので、遺伝的不安定状態はDNA二重鎖の修復過程で何らかの持続可能な細胞内変化が生ずることが原因となる可能性も十分に考えられる7）。さらに、遺伝的に不安定になった細胞では、活性酸素種の産生が持続的に先進し、持続的に遺伝子を攻撃し続けており、遅延型影響の発現に、細胞内における活性酸素の存在状態が密接に関係しているようである7･8）。放射線によって生じた二重鎮切断が修復される際に大規模な遺伝子欠失を伴う再結合が起きた際、その再結合領域に潜在的に不安定なクロマチン領域（クロマチン不安定領域；Potentially Unstable Chromatin Region; PUCR）が形成されるが、その構造は細胎内にそのまま存在し続けても細胞の生存に直接影響せず世代を越えて子孫細胞へ伝達されるので、このPUCRが遺伝的不安定性を記憶する仕組みかもしれない9）。 PUCRの存在はテロメア不安定性を誘導する10･11）。 ５．がん化した細胞では、染色体の数の異常が起きている それでは、何か細胞がん化の直接の原因であろうか？依然として不明なまま残された疑問である。私の研究では、放射線でがん化したハムスター細胞では、３番や11番染色体数が増加し、15番染色体が減少するなど特定の染色体の数に変化が起きていることがわかった。いわゆる染色体の異数化である。 しかし、この時点では、染色体の構造異常の増加は観察されない。同様の染色体の異数化は、放射線被ばく時に限らず、高密度培養によって誘導されたがん化細胞でも観察される。これらのことは、染色体の異数化が細胞がん化に密接かつ普遍的に関係する現象であることが予想できる。がん細胞で染色体の異数化が高頻度に起きることは、古くから多くの研究者が観察しており、このことからがん細胞では、染色体不安定化が生じていると考えられてきた。 しかし、私は、染色体の異数化は、がん細胞の特性であるというより細胞がん化の最初の引き金として重要な役割を果たしているのではないかと疑っている。ヒト細胞でも、一日1 cGyの低線量γ線を反復照射されると細胞形態の悪性化とそれに伴う染色体異数化を極めて高頻度に起こす。 しかし、マウス細胞と異なり不死化することは殆どなく、これがヒト細胞を実験的にがん化できない理由となっている。 なぜ染色体の異数化が起きるか、未だに明らかではない。 Hansemannは、100年以上前に、様々な癌組織切片を観察して、がん組織では、不均等分裂、分裂後期架橋と多極分裂が高頻度にみられることを発見した。これら三つの異常は染色体数の増加や減少の原因となる。 しかし、乳がんなどある種の固形癌では、最初にみられる染色体変化は、異数化ではなく倍数化であることが報告され、倍数化した細胞から分裂とともに染色体が抜け落ちて異数化する経路の存在が予想されている。どのようなメカニズムでこうした倍数化が起きるか明確ではないが、最近、倍数化した細胞の染色体に形態的にバランスのとれた相互転換(rearrangement)が存在することやテロメラーゼを持たない細胞で４倍体ができやすいので、染色体の不安定化にテロメアが関与している可能性が示唆されている。事実、放射線被ばくは、細胞のテロメアを短縮させ染色体末端の不安定化を起こす。不安定になった染色体末端は､融合(fusion)し染色体架橋(bridge)を生じさせ、分裂期に再切断(break)につながるFBBサイクル稼働のきっかけとなり、不安定化した染色体は様々な構造異常を生み出してゆくことになる。この機構の存在は、魅力的であるが、二動原体染色体が再切断して核と細胞質分裂を終えることができた細胞が実際に生き延びる確率は、細胞がん化頻度に比べて極めて低いと思われ、この経路が放射線による細胞がん化の主経路である可能性は低いと思われる。この推測は、中国の高自然放射線地域に住む住民の血液細胞では、二動原体染色体の頻度が増加しているが、住民のがん罹患率は低いという疫学調査の結果にも矛盾しない。さらに、染色体数の変化は分裂装置であるセントロゾーム(centrosome)数の変化と連動する。もっとも、現時点では、中心体の数的変化が細胞がん化の引き金なのか？細胞ががん化した結果なのか？明確な回答はない。しかし､乳がんの80％以上で、染色体構造異常や数的異常が、中心体の数的異常と相関することが知られているし、私の研究でも、放射線被ばくや高密度培養によって、セントロブームの数が異常になることが明らかである。 これら一連の結果は、テロメアやセントロゾームが放射線発がんの一次標的である可能性は極めて高いことを示唆している。 ６．放射線発がんの標的はタンパク質である 私は、これまでの三十年にわたる放射線細胞がん化機構に関する研究成果を総合的に解釈して、放射線発がんの一次標的は、DNAそのものではないと強く信ずるようになった。その想いを確実にしたのは、ビタミンＣによる放射線の遺伝的効果軽減効果の研究成果である。生体の80％以上は水であるため、遺伝的影響を含めて、放射線の生物影響の主因は水の放射線分解で生じたOHあるいはＨラジカルによるDNA損傷が直接の原因であると考えられてきた。しかし、私は、1990年初頭から見られるようになった細胞内の水の分布が均一でなくDNA近傍はかなり疎水性である”とする報告を考慮して、これまでの常識的な考え方と違って、“OHラジカルの様な活性ラジカルは直接DNAを攻撃しないのではないか？”という疑問を持つようになった。 その後、私は、Ｘ線照射された細胞内に実際に生じたラジカルを直接観察する技術を開発し、細胞内に常温における半減期がおよそ20時間と長く活性の低い高分子ラジカル（長寿命ラジカル）が誘導されることを発見した12）。この長寿命ラジカルは、ビタミンＣ処理で効率良く捕捉され、その消失に伴って突然変異と細胞がん化頻度が低下する13）。さらに驚くべきことに、ビタミンＣ処理による長寿命ラジカル捕捉効果と突然変異や細胞がん化頻度の軽減効果は、Ｘ線照射が終了した後、20時間を経た細胞でも観察されることが判った。一方、DMSO処理は活性の高いOH’ラジカルや02-ラジカルを効果的に捕捉でき、それに伴って細胞致死や染色体異常誘導を抑制することができる。しかし､DMSO処理をＸ線照射後に行ってもその効果は、全く認められない。最近、このラジカルが、酸素存在環境では、システインに生じた有機ラジカルであることを明らかにした14）。 これらの結果を総合的に判断して、私は、Ｘ線照射によって細胞内に生じた短寿命ラジカルは、遺伝物質（DNA）を直接攻撃し細胞死や染色体異常を起こすが､長寿命ラジカルは､遺伝物質（DNA）を直接攻撃せず致死や染色体異常を起こさない。しかし、突然変異や細胞がん化を引き起こす主因となると結論している。 こうした私の実験結果と推測が正しいとすると、現在、最も受け入れられている発がん機構説であり“DNA損傷→染色体異常→突然変異→発がん”という経路で発がんが起きるとする“発がんの突然変異説”に疑問を投げ掛けるものとなる。 ７．結論： これまでの私の研究成果は、放射線による細胞がん化（ひいては個体における発がん）の直接原因は、DNAであると考えるよりも、DNA以外のタンパクであると考える方が矛盾なく説明することができる。私は、「放射線発がんの第一次標的はタンパクである」とする“発がんタンパク標的説”を提案する。そして発がんの第一段階で染色体の異数化が密接に関連するので放射線による発がんの標的は、染色体分配装置であると考える。 このタンパク損傷を誘導する第一の候補は、生体が自身を維持するために必須のエネルギー産生や物質代謝に伴って生ずる“酸化ラジカル”である可能性が極めて高い。生体には、生体代謝活動に伴って生ずる酸化ラジカルを局所的および広域的に制御する機構（ラジカル消去機能）が備わっており、“酸素ラジカルの功罪”のバランスがうまくとられている。低線量放射線は、酸化ラジカル発生を先進するとともに、様々な生理活性を活性ｲﾋ （いわゆるホルミシス効果や適応応答現象など）するが、高線量放射線を受けバランスが大きく崩れると生命に危険が及ぶようになる。この状態になると救命的な様々な損傷修復機構（DNA損傷修復機構、アポトーシス、細胞周期制御機構など）が活性化される。放射線ストレスの場合、数100mSV程度の線量がその境目ではないだろうか？この予想が正しければ、100mSV以下の放射線量で誘導される酸化ラジカルは、内的ストレスによるラジカルと区別されることなく通常の生体生理活動で処理される。これを『生物学的閾値』と捉えることはできないだろうか？少なくとも低線量放射線の発がんのリスクをDNA標的説に基盤を置く『閾値なし直線仮説』で評価することはできないとするのが妥当ではないか？ この意味で低線量放射線の生体影響は、（１）高線量放射線に対する生体応答反応は低線量放射線のそれと大きく違う。（２）低線量放射線に対する生体応答を通常の生理活性に伴う一連の生体応答現象から切り離すことはできない。であろう。これら私の仮説について読者のご批判を仰ぎたい。 ８．参考文献 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